Методы

Условия и методы изоляции, культивирования, очистки и сохранения штаммов

Первым этапом при работе с почвенно-альгологическими пробами является получение накопительных смешанных культур. Этот этап объединяет приемы стимуляции роста и размножения цианобактерий и водорослей следующими наиболее распространенными методами: чашечные культуры со «стеклами обрастания», водно-почвенные культуры и культуры на жидких и твердых питательных средах. Далее обязательно следует очистка смешанных культур и доведение их до альгологически чистых штаммов, используя ряд приемов: посев штрихом, изоляция с помощью микропипетки, последовательного разведения, фототаксиса и антибиотиков. Альгологически чистые штаммы цианобактерий и водорослей поддерживаются в пластиковых культуральных пробирках на агаризованной (1–2%) питательной среде BG-11 (с азотом и без). В условиях интенсивного культивирования штаммы содержатся в культуральном боксе при температуре 23–25 °С и 12-часовом световом дне с интенсивностью освещения 60–75 μмоль • м–2 • с–1. В условиях длительного хранения штаммы содержатся в холодильном шкафу при температуре 12–15 °С и круглосуточном освещении с интенсивностью 20 μмоль • м–2 • с–1. Для поддержания коллекционных культур используется субкультивирование водорослей. Штаммы хранятся в двух повторностях.

Для характеристики штаммов Коллекции используются следующие методы:

  1. оптическая световая микроскопия (светлое поле и дифференциально интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) – для наблюдений за морфологией и жизненными циклами цианобактерий и водорослей (сроки наблюдения за штаммами составляют от 12 часов до 12 месяцев), а также для контроля за контаминацией культур;
  2. сканирующая электронная микроскопия с помощью микроскопа VEGA II LSU, Tescan (Чехия) – для получения данных о структуре поверхности клеток штаммов;
  3. молекулярно-генетический анализ, который включает процедуры выделения суммарной ДНК, амплификацию целевых фрагментов, их электрофоретическую детекцию и очистку перед секвенированием. Далее следует предварительная работа с генетическими базами данных (поиск гомологии по алгоритму BLAST, составление набора данных для дальнейшего анализа и др.), множественное выравнивание, определение эволюционной модели нуклеотидных замен, построение филогенетического дерева, статистическая оценка надежности топологии дерева и интерпретация результатов.